DNA的甲基化修飾是表觀遺傳研究中的一個(gè)熱點(diǎn)，在基因調(diào)控過(guò)程中扮演著重要的角色。它在維持組織特異性表達(dá)譜，使細(xì)胞獲得并保持特定狀態(tài)中起著重要作用。同時(shí)也調(diào)控著染色質(zhì)穩(wěn)定性、印跡基因表達(dá)調(diào)控、X染色體失活及抑制病毒和外源基因的表達(dá)等生物過(guò)程。更重要的是，在許多復(fù)雜疾病或生命過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展中，也與DNA甲基化對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，這些疾病包括：癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、老化以及發(fā)育。

Illumina在原450K芯片巨大成功的基礎(chǔ)上，推出了新一代的DNA甲基化芯片Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片（下文中以850K芯片代稱），為研究者提供了一個(gè)可靠且經(jīng)濟(jì)高效的甲基化分析平臺(tái)。850K芯片可檢測(cè)人全基因組約853,307個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，其中包含了原450K芯片91%的位點(diǎn)，并增加了413,745個(gè)位點(diǎn)（圖 1）。850K芯片不但保持了對(duì)CpG島，基因啟動(dòng)子區(qū)的全面覆蓋，還特別加強(qiáng)了增強(qiáng)子區(qū)（新增了333,265個(gè)探針覆蓋來(lái)自ENCODE及FANTOM5計(jì)劃的增強(qiáng)子）以及基因編碼區(qū)的探針覆蓋。廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞研究、腫瘤和其他復(fù)雜疾病研究，是目前最適合表觀基因組全關(guān)聯(lián)分析研究的全基因組DNA甲基化芯片。

芯片特點(diǎn)

• 覆蓋全面：檢測(cè)853,307個(gè)CpG位點(diǎn)；全面覆蓋CpG島、啟動(dòng)子、編碼區(qū)及增強(qiáng)子。
• 無(wú)需“甲基化DNA免疫共沉淀”，亞硫酸氫鹽處理基因組DNA即可進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)； Infinium探針設(shè)計(jì)，直接識(shí)別甲基化位點(diǎn)；
• 技術(shù)重復(fù)重現(xiàn)率>98%；
• 操作簡(jiǎn)單，無(wú)須PCR擴(kuò)增；模板量可低至250ng；
• 適用于FFPE樣品。

圖 1 Illumina Infinium MethylationEPIC (850K)芯片與450K芯片的異同

Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片對(duì)全基因組的全覆蓋

850K芯片對(duì)基因組的功能元件提供了空前全面覆蓋：CpG島、RefSeq基因、ENCODE開(kāi)放染色質(zhì)、ENCODE轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)以及FANTOM5增強(qiáng)子。領(lǐng)先的Infinium HD技術(shù)的保證了目標(biāo)區(qū)域超高密度覆蓋，同時(shí)還避免了甲基化DNA捕獲方法具有偏向性的缺點(diǎn)。850K芯片的一大特點(diǎn)是增加了很多由ENCODE項(xiàng)目中鑒定出來(lái)的潛在增強(qiáng)子。（ENCODE通過(guò)全面分析開(kāi)放染色質(zhì)、FAIRE實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，整合出基因組中最活躍的區(qū)域。）最后，芯片還覆蓋了FANTOM5項(xiàng)目鑒定得到的不同組織類型中的增強(qiáng)子。下圖及表格統(tǒng)計(jì)展示了850K芯片對(duì)于不同染色體、基因組功能元件的覆蓋及分布。以上的設(shè)計(jì)不但可從泛-增強(qiáng)子及編碼區(qū)域角度分析甲基化組，還在全基因組表觀遺傳關(guān)聯(lián)研究（EWAS）中發(fā)揮重要作用。850K芯片中所包含的系列有價(jià)值的位點(diǎn)：

• CpG島以外的CpG位點(diǎn)
• 人類肝細(xì)胞中的非CpG甲基化位點(diǎn)（CHH位點(diǎn)）
• 腫瘤（多種類型的癌癥）VS正常樣本中的不同甲基化位點(diǎn)，可以檢測(cè)多種樣本類型
• FANTOM5增強(qiáng)子
• ENCODE開(kāi)放染色質(zhì)和增強(qiáng)子
• 脫氧核糖核酸酶超敏位點(diǎn)
• miRNA啟動(dòng)子區(qū)域
• 涵蓋Infinium Methylation 450 BeadChip芯片中的＞90%的內(nèi)容

圖 2 850K芯片探針在不同染色體及基因組功能元件中的分布。

芯片數(shù)據(jù)的可靠性

Methylation EPIC BeadChip沿用了在450K芯片中取得成功的Infinium I及II探針設(shè)計(jì)（Figure 4）,以達(dá)到保證數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠的同時(shí)也達(dá)到對(duì)目標(biāo)區(qū)域全面覆蓋。Infinium II探針對(duì)目的CpG位點(diǎn)采用單個(gè)探針且序列中包含簡(jiǎn)并堿基設(shè)計(jì)，即使序列中有多達(dá)三個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)影響也不會(huì)對(duì)目的位點(diǎn)的結(jié)果造成影響。Illumina的科學(xué)家嚴(yán)格檢測(cè)每個(gè)產(chǎn)品，以確保強(qiáng)大而重復(fù)的性能，讓研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)行業(yè)領(lǐng)先的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

（1）Infinium Ⅰ 探針設(shè)計(jì)

在InfiniumI設(shè)計(jì)中對(duì)于每個(gè)甲基化位點(diǎn)，都對(duì)應(yīng)設(shè)計(jì)有兩種探針：M型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部為G，用來(lái)檢測(cè)甲基化位點(diǎn)（C）。U型磁珠尾部為A，用來(lái)檢測(cè)未甲基化位點(diǎn)(T)。根據(jù)單堿基延伸的原理，僅當(dāng)探針最后一個(gè)堿基與模板配對(duì)時(shí)，熒光標(biāo)記的核苷酸才能摻入并被檢測(cè)到熒光信號(hào)。通過(guò)分析M型與U型磁珠熒光信號(hào)的結(jié)果計(jì)算甲基化值。

（2）Infinium Ⅱ 探針設(shè)計(jì)

Infinium Ⅱ 探針只使用一種磁珠，探針末端為C，與目的位點(diǎn)的前一個(gè)堿基配對(duì)，只延伸一個(gè)堿基（ ddNTP-BioT， ddNTP-DNP）分別與非甲基化或甲基化位點(diǎn)配對(duì)。根據(jù)兩種熒光類型及計(jì)算目的位點(diǎn)的甲基化程度。

基于Infinium平臺(tái)的可靠性，850K芯片表現(xiàn)出非常完美的重復(fù)相關(guān)系數(shù)（r2＞0.98），而且850K芯片與450K芯片相同的位點(diǎn)的重復(fù)r2＞0.98，為850K與450K數(shù)據(jù)的整合分析建立了基礎(chǔ)。此外通過(guò)比較8個(gè)生物學(xué)樣品的重復(fù)的結(jié)果，850K芯片能可靠檢測(cè)0.2的delta-beta值，且假陽(yáng)性率低于1%。此外，芯片中設(shè)計(jì)了樣品依賴和樣品不依賴的內(nèi)參以保證數(shù)據(jù)的高質(zhì)量，例如專為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后而復(fù)雜度降低序列而設(shè)計(jì)的陰性對(duì)照。

圖 3 EPIC芯片自身技術(shù)重復(fù)間的相關(guān)性以及與450K相同探針間的相關(guān)性R方都在0.98以上。

850K芯片適用于FFPE樣品的甲基化研究

 Illumina為FFPE樣本的檢測(cè)改進(jìn)了protocol，以獲得更可靠成穩(wěn)定的結(jié)果。通過(guò)與新鮮樣本的比較，可見(jiàn)雖然FFPE樣本的檢出率受到樣本質(zhì)量的影響而下降，但FFPE樣本的技術(shù)重復(fù)的相關(guān)性R平方仍然高達(dá)0.98。對(duì)同一份樣本的冰凍樣本及FFPE樣本的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)依然很高（R=0.994）。

圖 4 850K芯片用于FFPE樣本時(shí)的技術(shù)重復(fù)相關(guān)性（R2>0.98）及檢出率(>90%)；相同標(biāo)本分別用FFPE處理與冰凍效果相比，重復(fù)相關(guān)性（R=0.994）。 

樣本要求

樣品類型：組織、細(xì)胞、基因組DNA

• 樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.7～2.0 之間；RNA 應(yīng)該去除干凈；不得有其它個(gè)體或其它物種的DNA污染。
• 樣品濃度：濃度不低于50ng/μl；
• 樣品總量：每個(gè)樣品總量不少于2μg 。
• 樣品溶劑：溶解在TE中。
• 樣品運(yùn)輸： DNA低溫運(yùn)輸（-20℃）；在運(yùn)輸過(guò)程中請(qǐng)用parafilm將管口密封好，以防出現(xiàn)污染。

數(shù)據(jù)分析

 詳細(xì)內(nèi)容同450K數(shù)據(jù)分析內(nèi)容，

詳見(jiàn)鏈接：http://www.shbio.cn/product/30.html

單位介紹

•        上海伯豪生物技術(shù)有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）是上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國(guó)家工程研究中心根據(jù)國(guó)內(nèi)外研發(fā)外包發(fā)展的需要，整合旗下系統(tǒng)技術(shù)平臺(tái)、商業(yè)化服務(wù)體系、高素質(zhì)服務(wù)團(tuán)隊(duì)等資源成立的致力于研發(fā)外包服務(wù)的專業(yè)化公司。

  上海伯豪生物技術(shù)有限公司擁有六大服務(wù)平臺(tái)：生物樣品分析平臺(tái)、微陣列芯片平臺(tái)、新一代測(cè)序平臺(tái)、生物標(biāo)志物平臺(tái)、分子檢測(cè)平臺(tái)、生物信息平臺(tái)，憑借高標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)平臺(tái)和多樣化的服務(wù)等競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，公司向國(guó)內(nèi)外企業(yè)和相關(guān)單位提供系統(tǒng)的生物學(xué)研究全面解決方案。目前正在為多達(dá)18家跨國(guó)制藥企業(yè)（包括排名前10位的跨國(guó)制藥企業(yè)）和超過(guò)3000家的國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu)、醫(yī)院等提供基因表達(dá)譜、基因分型、比較基因組學(xué)、DNA甲基化、miRNA、生物標(biāo)志物篩選及確認(rèn)、生物信息等技術(shù)服務(wù)。 

  公司擁有一支以上海為基礎(chǔ)，輻射全國(guó)的強(qiáng)大市場(chǎng)營(yíng)銷隊(duì)伍和銷售網(wǎng)絡(luò)，已設(shè)立華北、華南、華東三個(gè)大區(qū)十五個(gè)辦事處，推廣公司的主導(dǎo)技術(shù)服務(wù)、代理產(chǎn)品，快速提升公司品牌的知名度，擴(kuò)大影響力。過(guò)去10年承接項(xiàng)目數(shù)超過(guò)10000個(gè)，用戶單位3000家以上，協(xié)助客戶發(fā)表SCI論文700余篇（影響因子共計(jì)3000多分），全面推動(dòng)了中國(guó)基因組學(xué)服務(wù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 

  公司建立了規(guī)?；馁|(zhì)量控制體系，通過(guò)了ISO9001: 2008質(zhì)量技術(shù)體系的認(rèn)證，并參照GLP-L的標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)128個(gè)SOP文件對(duì)項(xiàng)目、樣品、實(shí)驗(yàn)過(guò)程、生物信息分析過(guò)程、數(shù)據(jù)信息管理、保密等進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控。尤其是數(shù)據(jù)管理，做到異地備份，保密管理。為用戶的數(shù)據(jù)真實(shí)性、可靠性提供了保證。

  公司的系統(tǒng)化技術(shù)平臺(tái)和高質(zhì)量的服務(wù)體系得到了廣大客戶認(rèn)可和合作伙伴的高度評(píng)價(jià)。公司平臺(tái)陸續(xù)獲得了國(guó)際知名高通量技術(shù)廠商Illumina、Affymetrix、Agilent、ABI的技術(shù)服務(wù)中心認(rèn)證。公司于2012年獲得諾華（CNIBR）優(yōu)秀供應(yīng)商獎(jiǎng)（Supplier Award 2012）。公司是Affymetrix公司在中國(guó)第一家認(rèn)證的服務(wù)提供商，是Agilent公司在國(guó)內(nèi)唯一認(rèn)證的服務(wù)提供商，先后被授予“Agilent公司亞太區(qū)最佳服務(wù)供應(yīng)商”和“Affymetrix公司優(yōu)秀服務(wù)商”稱號(hào)。

  
  

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